产品货号：
XH006
中文名称：
酵母线粒体DNA提取试剂盒
英文名称：
Yeast Mitochondrial DNA Extraction Kit
产品规格：
50T|100T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒用于从酵母中分离出完整而纯化的线粒体DNA。利用差速离心得到比较纯净的线粒体，再利用DNA酶消化和裂解缓冲系统等多步骤去掉核DNA，最后得到纯净的线粒体DNA。可用于PCR等对纯度要求较高的实验。
| 组分 | 50T | 100T | 保存条件 |
| DNase I | 12mg | 22mg | -20℃溶解后分装 |
| RNase A | 0.5mL | 1mL | -20℃保存经常使用可2～8℃放置 |
| 蜗牛酶 | 500mg | 1g | -20℃ |
| β-巯基乙醇 | 1.0mL | 1.0mL | RT |
| 山梨醇缓冲液 | 30mL | 60mL | 2～8℃ |
| 原生质体裂解液 | 100mL | 200mL | 2～8℃ |
| 线粒体清洗液 | 25mL | 50mL | 2～8℃ |
| DNA酶反应液 | 6mL | 12mL | 2～8℃ |
| 线粒体裂解液 | 10mL | 20mL | 常温放置，如有沉淀可37℃水浴 |
| 蛋白沉淀液 | 7.5mL | 15mL | 2～8℃ |
| 核酸助沉剂 | 0.5mL | 1mL | 2～8℃ |
| TE缓冲液 | 25mL | 50mL | 2～8℃ |
保存：2～8℃可保存一年，DNase I、RNase A和蜗牛酶-20℃保存。使用前，在DNase I中加入600μL（50T）或者1100μL（100T）的DNA酶反应液，分装后-20℃保存三个月，如果超过三个月，活性可能会降低，请自行订购DNase I。线粒体裂解液使用前常温保存，如有沉淀可37℃水浴溶解，不影响使用。
- 为保证获得完整及尽可能多的线粒体，匀浆条件要示：第一是全程低温操作。第二是快速。第三，如有条件可将匀浆后的碎片在显微镜下观察。
- 如进行Western Blot和2D-胶电泳，可直接在第6步的沉淀中加入上样缓冲液裂解线粒体。
- 线粒体DNA本身含量很低，如果电泳检测不到，可加大上样量，用更少量的TE溶解沉淀，或者直接进入PCR检测。
- 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。
在DNase I中加入600μL（50T）或者1100μL（100T）的DNA酶反应液，适当分装后-20℃保存。线粒体裂解液保存于常温，如有沉淀37℃水浴溶解，离心机温度下降到4℃（2～8℃），如无低温离心机，也可以常温离心，并将离心时间减半，但最后所得DNA品质及产量可能会有一定影响。
- 取新鲜培养的1～5mL酵母培养物(约5×107细胞，湿重50mg或者50μL体积)离心后的收集物（4℃，1000×g离心5min）。双蒸水洗一到两次。离心，尽量弃上清。取50μL山梨醇缓冲液洗一次，离心，弃上清。
- 酵母沉淀用0.5mL山梨醇缓冲液重悬，加入10mg蜗牛酶，再加入5μL β-巯基乙醇，混匀（如果一次提取样本较多，可取0.5mL山梨醇缓冲液重悬，加入10mg蜗牛酶，再加入5μL β-巯基乙醇预混匀，混匀后每管样本加入0.5mL重悬酵母），30℃水浴1～2小时。4℃，1000×g离心5min，弃上清，得到原生质体。将得到的原生质体用0.5mL原生质体裂解液重悬，再次离心，弃上清，得到原生质体。
- 将得到的原生质体用0.5mL原生质体裂解液重悬，并转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨10～20次；
- 将研磨物放置合适的离心管，4℃，1000×g离心5min；
- 取上清，加入一新的离心管中，4℃，16000×g离心10min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底。
- 在线粒体沉淀中加入0.5mL线粒体清洗液重悬线粒体沉淀，4℃，1000×g离心5min；取上清，加入一新的离心管中，4℃，16000×g离心10min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；
- 加入100μL DNA酶反应液重悬线粒体，吹打均匀后，再加入10μL DNASE I溶液（见准备工作），混匀，37℃水浴10min。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA。4℃，16000×g离心5min。尽可能的弃上清，再加入200μL TE重悬线粒体沉淀，4℃，16000×g离心5min，洗去残留的DNA酶。
- 得到的沉淀，用200μL TE缓冲液重悬线粒体沉淀，加入10μL RNase A。加入200μL线粒体裂解液，轻轻混匀（不可吹打），放置1～2min，再加入150μL蛋白沉淀液，迅速混匀。4℃，16000×g离心5min。此步骤可进一步去除核DNA。
- 取上清，加入一新的离心管中（如用于酶切分析，可加入此步：选用等体积的酚氯仿异戊醇25:24:1抽提一次，再用氯仿抽提一次，或者直接用氯仿抽提两次，一般来说，此步可去掉一些微量蛋白及糖类，但会造成线粒体DNA的损失，因而用于PCR时可省，并不影响后续实验），加入0.6倍体积的异丙醇（如无异丙醇，可加入2.5倍体积的乙醇沉淀DNA，如离心管太满可分两管）及5～10μL核酸核酸助沉剂，混匀，-20℃沉淀半小时左右（此步可省），4℃，16000×g离心10min。
- 弃上清，再加入1mL 70%乙醇清洗，4℃，16000×g离心5min。重复用70%乙醇洗一次。
- 弃上清，再次离心1min吸弃上清，不要碰到管底，开盖凉干约5～10min。
- 加入20～30μL TE缓冲液，轻弹管底，37℃水浴5分钟，线粒体DNA溶解。
- 进行DNA电泳检测及-20℃保存，进行下步的实验。
一般低温度心机都有离心力显示，如果没有，可以用以下公式简单的换算。
G＝1.11×(10-5)×R×[rpm]2
G为离心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍数来表示；[rpm]2即：转速的平方；R为半径，单位为厘米。
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